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导语

日前，上海俄罗斯贵宾会治疗集团关于低毒高效的新一代基因写入系统的最新研究进展入选2024年第27届美国基因与俄罗斯贵宾会治疗学会（ASGCT）年会。ASGCT成立于1996年，是全球最大的专业从事基因和俄罗斯贵宾会治疗研究的非赢利性学术组织。ASGCT年会是全球基因和俄罗斯贵宾会治疗领域规模最大的学术会议，为与会者提供了一个介绍最新基因与俄罗斯贵宾会治疗的国际平台。ASGCT大会每年吸引全球各地数以千计的学者、科学家、医生、FDA官员、工业界代表、投资人参加。上海俄罗斯贵宾会治疗集团联合扬州大学报道了一种全新、有效且安全的基因写入系统--JL 转座子系统，该 JL转座酶和太质粒的JL转座子系统具有高转座效率和低DNA俄罗斯贵宾会毒性特征，基于JL转座子系统制备的CAR-T俄罗斯贵宾会具有俄罗斯贵宾会活率高、癌变风险低以及肿瘤俄罗斯贵宾会杀伤活力强的特点。目前上海俄罗斯贵宾会治疗集团利用该系统正在开展30小时快速型CAR-T俄罗斯贵宾会生产工艺研究及临床研究探索。

摘要号 - P737

摘要题目

The JL Transposon System: A Novel, Efficient, and Safe Tool for Gene and Cell Therapy with Lower Cytotoxicity and Enhanced Transposition Efficiency

摘要内容

将外源基因高效递送至靶俄罗斯贵宾会，保持长期稳定表达，并尽可能地减少俄罗斯贵宾会和基因毒性一直是基因治疗领域内所面临的挑战。基于DNA转座子的外源基因递送同样面临上述问题，需要进一步提高转座整合效率和降低DNA使用剂量从而降低俄罗斯贵宾会毒性。

图 1 高效率及高安全性JL转座系统开发策略

上海俄罗斯贵宾会治疗集团联合扬州大学通过大数据基因组分析从三棘鱼（Gasterosteus aculeatus）基因组内发现了新型PS转座子，采用定向进化的多种技术手段获得了新型高效的JL转座子系统，已实现了比野生型PS转座酶高十余倍的效率提升。与此同时，我们还开发了无抗生素太质粒DNA（Tiniplasmid）生产体系，通过最小化骨架DNA，促进俄罗斯贵宾会核转导效率，进一步提高了JL基因写入系统整体效能。

图 2 工程化高效PS 转座酶。A. SWISS-MODEL 通过自动同源建模技术生成 PS 转座酶二聚体理论模型；B. 工程高效PS 转座酶（以 JL 转座酶为例）结构域组织示意图；C. 评估不同工程化 PS/JL 转座酶变体在 CHO 俄罗斯贵宾会中转座效率提高。

为了更好评估JL基因写入系统在GCT领域的应用潜力，在本次ASGCT的Poster文章中，我们对基于JL转座子进行CAR-T俄罗斯贵宾会制造的生物学特性进行了全面评价。研究结果表明，JL 转座子系统在同等条件下比 PiggyBac (PB) 和睡美人 (SB) 等经典系统具有更高效的转座效率，同时还可实现低质粒剂量和低T俄罗斯贵宾会俄罗斯贵宾会毒性，高CAR-T 增殖活性。

图 3 以转座酶 mRNA 和转座子 Tiniplasmid® 制备CAR-T的优势。A. Tiniplasmid 的示意图；B-C. 与标准质粒和 PB 转座酶 mRNA 相比，Tiniplasmid 和 JL 转座酶 mRNA 具有更高的转座效率、更低的俄罗斯贵宾会毒性和更快的俄罗斯贵宾会增殖特性。

图 4 基于 MSLN CAR 的 JL 转座子系统的体外评估。A. MSLN CAR-T 的制备和检测流程图；B. 第 9 天 CAR+ 表达的T俄罗斯贵宾会转座效率评价图；C. RTCA 检测显示 MSLN CAR-T 俄罗斯贵宾会与肿瘤靶俄罗斯贵宾会以 1:2 的 E:T 比例共培养 24/48/72 小时后的 MSLN 特异性俄罗斯贵宾会毒性。NT为对照（n=7）。

为了研究潜在的遗传毒性，我们使用荧光素酶测定比较了 JL 和传统转座子系统之间的末端反向重复 (TIR) 非特异性启动子活性。结果表明，JL系统的28bp TIR为目前发现的最短转座子TIR序列，具有最低的非特异性启动子活性，对内源性基因干扰最小。

图 5 超短型TIR 及其非特异性启动子活性。A. 在广泛应用于 GCT 的转座子中，JL 转座子的 28 bp TIR 序列是最短的，这非常有利于减小转座子质粒的大小，从而提高转座效率；B. 此外，与其他转座子相比，JL 转座子的 TIR 相关非特异性启动子活性最低。SB：睡美人转座子 TIR，PB：PiggyBac转座子TIR，JL-PS：Passer转座子TIR。

此外，我们使用连接子介导的靶标扩增 PCR (LTA-PCR)、二代测序和生物信息学工具进行了全基因组整合位点分析 (ISA)，以分析 JL 转座子的整合位点特征。结果表明，675 个独特的整合位点随机分布在整个基因组中，IS 没有在转录起始位点 (TSS)附近的偏好性。平均而言，69.14% 的独特整合位点 (UIS) 发生在基因内（79.67% 在基因 ± 10 kb 内），其中绝大多数插入位点在内含子区。所有与癌症相关基因相关的位点的相对计数比低于0.5%，并且在整合位点内没有发现与已知的俄罗斯贵宾会和基因治疗不良事件相关的基因。此外，从上述插入位点分析结果来看，没有发现整合聚集性热点。

图 6 利用连接靶标扩增 PCR（LTA-PCR）绘制的 JL 转座子整合图谱和 UISs 的全基因组图谱。A. 样本中检测到的十个代表性最强的 UISs 的累积频率；B. 多克隆-单克隆距离（PMD）分析。克隆多样性根据雷尼熵进行评估，PMD 分析基于两个因素：均匀度和丰富度。

C. 载体整合在染色体中的分布；D. 载体整合在转录起始位点周围的分布。硅学：计算机模拟的随机整合参考。

E-F. 载体整合在基因区的分布。E：基因内或基因内 ±10 kb。F：在外显子或内含子中。

G. 癌症相关基因 TSS 上下游 100 kb 范围内 IS 的相对贡献；H. 所有检测到的共同整合位点直观显示的载体整合热点分布。每个蓝色圆圈代表一个点；红色文字显示整合热点基因名称。

结论：

1. 基于同源保守性的半理性设计PS 转座酶突变体，和亮氨酸拉链融合蛋白策略，我们获得了一个工程化高效JL 转座酶和转座子系统。

2. 基于工程化高效JL转座酶mRNA和太质粒的转座子系统具有高转座效率和低DNA俄罗斯贵宾会毒性特征。

3. 基于JL转座酶系统制备的CAR-T俄罗斯贵宾会具有很强的杀伤肿瘤俄罗斯贵宾会的能力。

4. 基于JL转座酶系统制备的CAR-T 俄罗斯贵宾会具有低基因毒性和高安全性。

这些研究表明，JL 转座子系统是基因和俄罗斯贵宾会治疗的一种全新、有效且安全的新型递送方法，并且是未来研究和临床应用的有前途的工具。